Kluczowa różnica - sekwencjonowanie NGS vs Sanger
Sekwencjonowanie Nowej Generacji (NGS) i Sekwencjonowanie Sangera to dwa rodzaje technik sekwencjonowania nukleotydów opracowane na przestrzeni czasu. Metoda Sanger Sequencing była szeroko stosowana przez wiele lat, a firma NGS niedawno ją zastąpiła ze względu na jej zalety. Kluczową różnicą między NGS a sekwencjonowaniem Sangera jest to, że NGS działa na zasadzie sekwencjonowania milionów sekwencji jednocześnie w szybki sposób poprzez system sekwencjonowania, podczas gdy Sekwencjonowanie Sangera działa na zasadzie zakończenia łańcucha dzięki selektywnemu włączeniu dideoksynukleotydów przez enzym polimerazy DNA podczas replikacji DNA i wynikającego z tego rozdziału fragmentów za pomocą elektroforezy kapilarnej.
SPIS TREŚCI
1. Przegląd i kluczowe różnice
2. Co to jest sekwencjonowanie nukleotydów
3. Co to jest NGS
4. Co to jest sekwencjonowanie Sangera
5. Porównanie obok siebie - sekwencjonowanie NGS vs Sanger
6. Podsumowanie
Co to jest sekwencjonowanie nukleotydów?
Informacja genetyczna jest przechowywana w sekwencjach nukleotydowych DNA lub RNA organizmu. Proces ustalania prawidłowej kolejności nukleotydów (przy użyciu czterech zasad) w danym fragmencie (w genie, klastrze genów, chromosomie i całym genomie) nazywany jest sekwencjonowaniem nukleotydów. Analiza struktury i funkcji genów jest bardzo ważna w badaniach genomicznych, kryminalistycznych, wirusologii, systematyki biologicznej, diagnostyce medycznej, biotechnologii i wielu innych dziedzinach. Istnieją różne rodzaje metod sekwencjonowania opracowanych przez naukowców. Wśród nich sekwencjonowanie Sangera opracowane przez Fredericka Sangera w 1977 roku było szeroko stosowane i spopularyzowane przez długi czas, dopóki nie zastąpiło go sekwencjonowanie następnej generacji.
Co to jest NGS?
Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to termin używany w odniesieniu do nowoczesnych procesów sekwencjonowania o dużej przepustowości. Opisuje szereg różnych nowoczesnych technologii sekwencjonowania, które zrewolucjonizowały badania genomiczne i biologię molekularną. Techniki te to sekwencjonowanie Illumina, sekwencjonowanie Roche 454, sekwencjonowanie protonów jonowych i sekwencjonowanie SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Systemy NGS są szybsze i tańsze. W systemach NGS stosowane są cztery główne metody sekwencjonowania DNA, a mianowicie; pirosekwencjonowanie, sekwencjonowanie przez syntezę, sekwencjonowanie przez ligację i sekwencjonowanie półprzewodników jonowych. Wiele nici DNA lub RNA (miliony) może być sekwencjonowanych równolegle. Umożliwia sekwencjonowanie całego genomu organizmów w krótkim okresie czasu, w przeciwieństwie do sekwencjonowania Sangera, które zajmuje więcej czasu.
NGS ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalną metodą sekwencjonowania Sangera. Jest to szybki, dokładniejszy i bardziej ekonomiczny proces, który można przeprowadzić przy małej wielkości próbki. NGS można stosować w badaniach metagenomicznych, do wykrywania zmian w obrębie indywidualnego genomu spowodowanych insercjami i delecjami itp. Oraz w analizie ekspresji genów.
Rysunek_1: Rozwój w sekwencjonowaniu NGS
Co to jest sekwencjonowanie Sangera?
Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania opracowana przez Fredericka Sangera i jego współpracowników w 1977 r. W celu określenia dokładnej kolejności nukleotydów danego fragmentu DNA. Jest również znany jako sekwencjonowanie terminacji łańcucha lub sekwencjonowanie Dideoksy. Zasada działania tej metody polega na przerywaniu syntezy nici przez selektywne włączanie dideoksynukleotydów kończących łańcuch (ddNTP), takich jak ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP, przez polimerazę DNA podczas replikacji DNA. Normalne nukleotydy mają grupy 3 'OH do tworzenia wiązania fosfodiestrowego między sąsiednimi nukleotydami, aby kontynuować tworzenie nici. Jednak ddNTP nie mają tej grupy 3 'OH i nie są w stanie tworzyć wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami. W związku z tym wydłużanie się łańcucha zostaje wstrzymane.
W tej metodzie jednoniciowy DNA, który ma być sekwencjonowany, służy jako nić matrycowa do syntezy DNA in vitro. Inne wymagania to starter oligonukleotydowy, prekursory deoksynukleotydów i enzym polimerazy DNA. Gdy znane są flankujące końce fragmentu docelowego, można łatwo zaprojektować startery do replikacji DNA. W czterech oddzielnych probówkach przeprowadza się cztery oddzielne reakcje syntezy DNA. Każda rura ma oddzielne ddNTP, wraz z innymi wymaganiami. Z konkretnego nukleotydu dodaje się mieszaninę dNTP i ddNTP. Podobnie cztery oddzielne reakcje przeprowadza się w czterech probówkach z czterema mieszaninami. Po reakcjach przeprowadza się wykrywanie fragmentów DNA i konwersję wzorca fragmentów na informację o sekwencji. Powstałe fragmenty DNA są denaturowane termicznie i rozdzielane przez elektroforezę żelową. Jeśli stosuje się nukleotydy radioaktywne, wzór prążków w żelu poliakryloamidowym można wizualizować za pomocą autoradiografii. Gdy ta metoda wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie dideoksynukleotydy, można osłabić odczyt w żelu i przepuścić przez wiązkę lasera w celu wykrycia przez detektor fluorescencyjny. Aby uniknąć błędów, które mogą powstać, gdy sekwencja jest odczytywana przez oko i wprowadzana ręcznie do komputera, metoda ta rozwinęła się w wykorzystaniu automatycznego sekwencera połączonego z komputerem. Aby uniknąć błędów, które mogą powstać, gdy sekwencja jest odczytywana przez oko i wprowadzana ręcznie do komputera, metoda ta rozwinęła się w wykorzystaniu automatycznego sekwencera połączonego z komputerem. Aby uniknąć błędów, które mogą powstać, gdy sekwencja jest odczytywana przez oko i wprowadzana ręcznie do komputera, metoda ta rozwinęła się w wykorzystaniu automatycznego sekwencera połączonego z komputerem.
Jest to metoda stosowana do sekwencjonowania DNA z projektu Human Genome. Ta metoda jest nadal używana z zaawansowanymi modyfikacjami, ponieważ zapewnia dokładne informacje o sekwencji, mimo że jest to kosztowny i powolny proces.
Rysunek_2: Sekwencjonowanie Sangera
Jaka jest różnica między NGS a sekwencjonowaniem Sangera?
Porównaj środek artykułu przed tabelą
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) odnosi się do nowoczesnych procesów sekwencjonowania o dużej przepustowości. Opisuje szereg różnych nowoczesnych technologii sekwencjonowania | Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania opracowana przez Fredericka Sangera w celu określenia dokładnej kolejności nukleotydów danego fragmentu DNA. |
| Opłacalność | |
| NGS to tańszy proces, ponieważ ogranicza czas, siłę roboczą i środki chemiczne. | Jest to kosztowny proces, ponieważ wymaga czasu, siły roboczej i większej ilości środków chemicznych. |
| Prędkość | |
| Jest to szybsze, ponieważ zarówno wykrywanie chemiczne, jak i wykrywanie sygnału wielu nici odbywa się równolegle. | Jest to czasochłonne, ponieważ wykrywanie chemikaliów i wykrywanie sygnału odbywa się jako dwa oddzielne procesy i tylko na jednym pasmie można odczytywać jednocześnie. |
| Niezawodność | |
| NGS jest niezawodne. | Sekwencjonowanie Sangera jest mniej niezawodne |
| Wielkość próbki | |
| NGS wymaga mniejszej ilości DNA. | Ta metoda wymaga dużej ilości matrycowego DNA. |
| Zasady DNA na sekwencjonowany fragment | |
| Liczba zasad DNA na sekwencjonowany fragment jest niższa niż w metodzie Sangera | Sekwencje generujące są dłuższe niż sekwencje NGS. |
Podsumowanie - sekwencjonowanie NGS vs Sanger
NGS i Sanger Sequencing to techniki sekwencjonowania nukleotydów szeroko stosowane w biologii molekularnej. Sekwencjonowanie Sangera to wczesna metoda sekwencjonowania, która została zastąpiona przez NGS. Główna różnica między NGS a sekwencjonowaniem Sangera polega na tym, że NGS jest procesem szybkim, dokładniejszym i bardziej opłacalnym niż sekwencjonowanie Sangera. Obie techniki spowodowały wybuchy epidemii w genetyki i biotechnologii.
