Kluczowa różnica - sekwencjonowanie Sangera a pirosekwencjonowanie
Sekwencjonowanie DNA jest bardzo ważne dla analizy DNA, ponieważ znajomość prawidłowego rozmieszczenia nukleotydów w określonym regionie DNA dostarcza wielu ważnych informacji na jego temat. Istnieją różne metody sekwencjonowania DNA. Sekwencjonowanie Sangera i pirosekwencjonowanie to dwie różne metody sekwencjonowania DNA szeroko stosowane w biologii molekularnej. Kluczowa różnica między sekwencjonowaniem Sangera a pirosekwencjonowaniem polega na tym, że sekwencjonowanie Sangera wykorzystuje dideoksynukleotydy do zakończenia syntezy DNA w celu odczytania sekwencji nukleotydów, podczas gdy pirosekwencjonowanie wykrywa uwolnienie pirofosforanu poprzez włączenie nukleotydów i syntezę sekwencji komplementarnej w celu odczytania dokładnej kolejności sekwencji.
SPIS TREŚCI
1. Omówienie i kluczowe różnice
2. Czym jest sekwencjonowanie Sangera
3. Co to jest sekwencjonowanie Sangera
4. Porównanie obok siebie - sekwencjonowanie Sangera a pirosekwencjonowanie
5. Podsumowanie
Co to jest sekwencjonowanie Sangera?
Sekwencjonowanie Sangera jest metodą sekwencjonowania DNA pierwszej generacji, opracowaną przez Fredericka Sangera i jego koledzy w 1977 r. Znane jest również jako sekwencjonowanie zakończenia łańcucha lub sekwencjonowanie Dideoksy, ponieważ opiera się na terminacji łańcucha przez dideoksynukleotydy (ddNTP). Ta metoda była szeroko stosowana przez ponad 30 lat, do czasu opracowania sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Technika sekwencjonowania Sangera umożliwiła odkrycie prawidłowej kolejności nukleotydów lub przyłączenie konkretnego fragmentu DNA. Opiera się na selektywnym wbudowaniu ddNTPs i zakończeniu syntezy DNA podczas replikacji DNA in vitro. Brak grup 3 'OH, aby kontynuować tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi nukleotydami, jest unikalną cechą ddNTP. W związku z tym po przyłączeniu ddNTP wydłużanie łańcucha ustaje i kończy się od tego punktu. Istnieją cztery ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP - używane w sekwencjonowaniu Sangera. Te nukleotydy zatrzymują proces replikacji DNA, gdy są włączane do rosnącej nici DNA i skutkują różną długością krótkiego DNA. Elektroforeza w żelu kapilarnym służy do uporządkowania tych krótkich nici DNA według ich rozmiarów na żelu, jak pokazano na rysunku 01.
Rysunek 1: Kapilarna elektroforeza w żelu zsyntetyzowanego krótkiego DNA
W przypadku replikacji DNA in vitro należy spełnić kilka wymagań. Są to enzym polimerazy DNA, matrycowy DNA, startery oligonukleotydowe i deoksynukleotydy (dNTP). W sekwencjonowaniu Sangera replikacja DNA jest przeprowadzana w czterech oddzielnych probówkach wraz z czterema rodzajami ddNTP oddzielnie. Deoksynukleotydy nie są całkowicie zastępowane przez odpowiednie ddNTP. Mieszanina konkretnego dNTP (na przykład; dATP + ddATP) jest zawarta w probówce i replikowana. Cztery oddzielne probówki naniesiono na żel w czterech oddzielnych dołkach. Następnie, odczytując żel, można skonstruować sekwencję, jak pokazano na rysunku 02.
Rysunek 02: Sekwencjonowanie Sangera
Sekwencjonowanie Sangera to ważna technika, która pomaga w wielu dziedzinach biologii molekularnej. Projekt ludzkiego genomu został pomyślnie zakończony przy pomocy metod opartych na sekwencjonowaniu Sangera. Sekwencjonowanie Sangera jest również przydatne w sekwencjonowaniu docelowego DNA, badaniach nad rakiem i chorobami genetycznymi, analizie ekspresji genów, identyfikacji ludzi, wykrywaniu patogenów, sekwencjonowaniu drobnoustrojów itp.
Sekwencjonowanie Sangera ma kilka wad:
- Długość sekwencjonowanego DNA nie może przekraczać 1000 par zasad
- Jednocześnie można zsekwencjonować tylko jedną nić.
- Proces jest czasochłonny i kosztowny.
Dlatego z czasem opracowano nowe zaawansowane techniki sekwencjonowania, aby przezwyciężyć te problemy. Jednak sekwencjonowanie Sangera jest nadal w użyciu ze względu na jego bardzo dokładne wyniki do fragmentów o długości około 850 par zasad.
Co to jest Pyrosequencing?
Pirosekwencjonowanie to nowa technika sekwencjonowania DNA oparta na „sekwencjonowaniu przez syntezę”. Technika ta polega na wykrywaniu uwalniania pirofosforanu po włączeniu nukleotydu. Proces jest wykorzystywany przez cztery różne enzymy: polimery DNA, sulfurylazę ATP, lucyferazę i apirazę oraz dwa substraty: adenozyny 5 'fosfosiarczan (APS) i lucyferynę.
Proces rozpoczyna się od wiązania startera z jednoniciową matrycą DNA, a polimeraza DNA rozpoczyna inkorporację komplementarnych do niej nukleotydów. Kiedy nukleotydy łączą się ze sobą (polimeryzacja kwasu nukleinowego), uwalnia pirofosforanowe (dwie połączone ze sobą grupy fosforanowe) grupy i energię. Każdy dodatek nukleotydu uwalnia równomolową ilość pirofosforanu. Pirofosforan przekształca się w ATP przez sulfurylazę ATP w obecności substratu APS. Wygenerowany ATP kieruje konwersją lucyferyny do oksylucyferyny, w której pośredniczy lucyferaza, wytwarzając światło widzialne w ilościach, które są proporcjonalne do ilości ATP. Światło jest wykrywane przez urządzenie do wykrywania fotonów lub przez fotopowielacz i tworzy pirogram. Apyraza rozkłada ATP i niewłączone dNTP w mieszaninie reakcyjnej. Dodawanie dNTP jest wykonywane jednorazowo. Ponieważ dodanie nukleotydu jest znane na podstawie inkorporacji i detekcji światła, można określić sekwencję matrycy. Pyrogram służy do generowania sekwencji nukleotydów próbki DNA, jak pokazano na rysunku 03.
Pirosekwencjonowanie jest bardzo ważne w analizie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu i sekwencjonowaniu krótkich odcinków DNA. Wysoka dokładność, elastyczność, łatwość automatyzacji i równoległe przetwarzanie to zalety pirosekwencjonowania w porównaniu z technikami sekwencjonowania Sangera.
Rysunek 03: Pirosekwencjonowanie
Jaka jest różnica między sekwencjonowaniem Sangera a pirosekwencjonowaniem?
Porównaj środek artykułu przed tabelą
Sekwencjonowanie Sangera a pirosekwencjonowanie |
|
| Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania DNA oparta na selektywnym włączaniu ddNTP przez polimerazę DNA i terminacji łańcucha. | Pirosekwencjonowanie jest metodą sekwencjonowania DNA opartą na wykrywaniu uwalniania pirofosforanu po włączeniu nukleotydu. |
| Korzystanie z ddNTP | |
| ddNTP są używane do zakończenia replikacji DNA | ddNTP nie są używane. |
| Zaangażowane enzymy | |
| Stosowana jest polimeraza DNA. | Wykorzystywane są cztery enzymy: polimeraza DNA, sulfurylaza ATP, lucyferaza i apyraza. |
| Zastosowane podłoża | |
| APS i Lucyferin nie są używane. | Stosuje się 5 'fosfosiarczan adenozyny (APS) i lucyferynę. |
| Maksymalna temperatura | |
| To jest powolny proces. | To szybki proces. |
Podsumowanie - Sekwencjonowanie Sangera vs Pirosekwencjonowanie
Sekwencjonowanie Sangera i pirosekwencjonowanie to dwie metody sekwencjonowania DNA stosowane w biologii molekularnej. Sekwencjonowanie Sangera konstruuje kolejność nukleotydów w sekwencji przez zakończenie wydłużania łańcucha, podczas gdy pirosekwencjonowanie konstruuje dokładną kolejność nukleotydów w sekwencji przez włączenie nukleotydów i wykrywanie uwalniania pirofosforanów. Dlatego główna różnica między sekwencjonowaniem Sangera a pirosekwencjonowaniem polega na tym, że sekwencjonowanie Sangera działa na sekwencjonowanie przez zakończenie łańcucha, podczas gdy pirosekwencjonowanie działa na sekwencjonowanie przez syntezę.
