Kluczowa różnica - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotydy to podstawowe jednostki strukturalne i elementy budulcowe DNA. Cząsteczka DNA składa się z łańcucha polinukleotydowego. W DNA znajdują się cztery różne nukleotydy. Te nukleotydy składają się z czterech różnych zasad azotowych nazwanych A (adenina), G (guanina), C (cytozyna), T (tymina). Kolejność nukleotydów w cząsteczce DNA ma ogromne znaczenie, ponieważ koduje ważną informację genetyczną dla wzrostu i rozwoju organizmów. Sekwencjonowanie DNA odnosi się do procesu, który określa dokładną sekwencję nukleotydów DNA. Istnieją różne metody sekwencjonowania DNA. Sekwencjonowanie Maxama Gilberta i sekwencjonowanie DNA Sangera to dwie metody sekwencjonowania DNA, które należą do sekwencjonowania pierwszej generacji. Procedura sekwencjonowania Maxama Gilberta określa sekwencję zasad przez chemiczne rozszczepienie fragmentów DNA znakowanych końcami 5 ', preferencyjnie na każdym z czterech nukleotydów i elektroforezę żelową. Procedura sekwencjonowania Sangera określa sekwencję nukleotydów poprzez syntezę jednoniciowego DNA przy użyciu polimerazy DNA i dideoksynukleotydów oraz elektroforezy żelowej. To jest kluczowa różnica między Maxamem Gilbertem a Sanger Sequencing.
SPIS TREŚCI
1. Omówienie i kluczowa różnica
2. Co to jest Maxam Gilbert
3. Co to jest sekwencjonowanie Sangera
4. Porównanie obok siebie - Sekwencjonowanie Maxama Gilberta i Sangera
5. Podsumowanie
Co to jest sekwencjonowanie Maxama Gilberta?
Sekwencjonowanie Maxama Gilberta, znane również jako metoda sekwencjonowania chemicznego, to technika opracowana w celu określenia kolejności nukleotydów w DNA. Ta metoda została wprowadzona przez Waltera Gilberta i Alana Maxama w 1976 roku i stała się popularna, ponieważ można ją stosować bezpośrednio z oczyszczonym DNA. Metoda Maxama Gilberta należy do pierwszej generacji sekwencjonowania DNA i była to pierwsza metoda sekwencjonowania szeroko stosowana przez naukowców.
Podstawowa zasada tej metody polega na ograniczeniu znakowanych na końcach fragmentów DNA do określonych zasad przez specyficzne dla zasady chemikalia i warunki oraz rozdzielenie wyznakowanych fragmentów za pomocą elektroforezy, jak pokazano na rysunku 01. Fragmenty są rozdzielane według ich rozmiarów żel. Ponieważ fragmenty są znakowane, można łatwo wydedukować sekwencję cząsteczki DNA.
Metoda Maxama Gilberta wykorzystuje specyficzne substancje chemiczne do rozbijania DNA na określonych zasadach. Do selektywnego ataku, odpowiednio, na puryny i pirymidyny stosuje się dwie popularne substancje chemiczne, zwane siarczanem dimetylu i hydrazyną.
Metoda sekwencjonowania Maxama Gilberta jest wykonywana w kilku etapach w następujący sposób.
- Oczyszczanie sekwencji DNA przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych
- Znakowanie końców fragmentów DNA przez dodanie radioaktywnych fosforanów
- Oczyszczanie wyznakowanych fragmentów z nieznakowanych fragmentów metodą elektroforezy żelowej
- Rozdzielenie znakowanego na końcu DNA na cztery probówki i osobne traktowanie podstawowymi substancjami chemicznymi
- Elektroforeza zawartości każdej probówki na oddzielnych liniach na żelu i rozdział fragmentów w zależności od ich długości.
- Wykrywanie fragmentów metodą autoradiografu.
Rysunek 01: Sekwencjonowanie Maxama Gilberta
Co to jest sekwencjonowanie Sangera?
Sekwencjonowanie Sangera to metoda sekwencjonowania opracowana przez Fredericka Sangera i jego współpracowników w 1977 r. W celu określenia sekwencji zasad danego fragmentu DNA. Jest również znany jako sekwencjonowanie terminacji łańcucha lub metoda sekwencjonowania Dideoksy. Metoda ta działa na zasadzie selektywnego włączania przez polimerazę DNA jednoniciowego DNA dideoksynukleotydów kończących łańcuch (ddNTP), takich jak ddGTP, ddCTP, ddATP i ddTTP, przez polimerazę DNA podczas syntezy jednoniciowego DNA w celu zakończenia tworzenia nici. Dideoksynukleotydy nie mają grup 3 'OH do tworzenia wiązań fosfodiestrowych z sąsiednim nukleotydem. W związku z tym tworzenie nici zatrzymuje się po włączeniu ddNTP do nowo tworzącej się nici podczas sekwencjonowania Sanger.
W tej metodzie cztery oddzielne reakcje syntezy DNA (PCR) przeprowadza się w czterech oddzielnych probówkach z jednym rodzajem ddNTP. Dostarczane są również inne wymagania dotyczące probówek do PCR, w tym startery, dNTP, polimeraza Taq, specyficzne warunki itp. Cztery oddzielne reakcje są przeprowadzane w czterech probówkach z czterema mieszaninami. Po reakcjach PCR powstałe fragmenty DNA są denaturowane termicznie i rozdzielane przez elektroforezę żelową. Następnie fragmenty wizualizuje się za pomocą znakowanego (radioaktywnego lub fluorescencyjnego) startera lub dNTP, jak pokazano na rysunku 02.
Rysunek 02: Sekwencjonowanie Sangera
Jaka jest różnica między Maxamem Gilbertem a Sanger Sequencing?
Porównaj środek artykułu przed tabelą
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Sekwencjonowanie Maxama Gilberta to pierwsza technika opracowana do sekwencjonowania DNA. | Metoda sekwencjonowania Sangera została wprowadzona po metodzie sekwencjonowania Maxama Gilberta. |
| Stosowanie | |
| Ta metoda jest rzadko używana. | Sekwencjonowanie Sangera jest rutynowo stosowane do sekwencjonowania. |
| Stosowanie niebezpiecznych chemikaliów | |
| Wykorzystuje niebezpieczne chemikalia. | Stosowanie niebezpiecznych chemikaliów jest ograniczone w porównaniu z metodą Maxama Gilberta. |
| Etykietowanie do wykrywania | |
| Metoda ta wykorzystuje P radioaktywnego 32 do znakowania końce fragmentami DNA. | Sekwencjonowanie Sangera wykorzystuje ddNTP znakowane radioaktywnie lub fluorescencyjnie. |
Podsumowanie - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Sekwencjonowanie Maxama Gilberta i Sangera to dwa rodzaje technik sekwencjonowania DNA wchodzące w zakres sekwencjonowania DNA pierwszej generacji. Sekwencjonowanie Maxama Gilberta jest pierwszą metodą wprowadzoną do sekwencjonowania DNA w 1976 roku i jest wykonywane przez rozbicie znakowanych na końcach fragmentów DNA przez chemikalia specyficzne dla zasady. Dlatego nazywa się to sekwencjonowaniem chemicznym. Metoda sekwencjonowania Sangera została wprowadzona w 1977 roku i opiera się na reakcjach terminacji łańcucha sterowanych przez ddNTP. Metoda sekwencjonowania Sangera popularna niż metoda Maxama Gilberta ze względu na kilka wad metody Maxama Gilberta, takich jak nadmierne zużycie czasu, stosowanie niebezpiecznych chemikaliów itp. Na tym polega różnica między sekwencjonowaniem Maxama Gilberta i Sangera.
