Kluczowa różnica - PCR vs sekwencjonowanie DNA
PCR i sekwencjonowanie DNA to dwie ważne techniki w biologii molekularnej. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to proces, w wyniku którego powstaje duża liczba kopii fragmentu DNA. Sekwencjonowanie DNA to technika, która pozwala ustalić dokładną kolejność nukleotydów danego fragmentu DNA. To jest kluczowa różnica między PCR a sekwencjonowaniem DNA. PCR jest jednym z głównych etapów sekwencjonowania DNA.
SPIS TREŚCI
1. Przegląd i kluczowe różnice
2. Czym jest PCR
3. Co to jest sekwencjonowanie DNA
4. Porównanie bezpośrednie - PCR vs sekwencjonowanie DNA
5. Podsumowanie
Co to jest PCR?
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika amplifikacji DNA stosowana w biologii molekularnej. Tworzy od tysięcy do milionów kopii określonego fragmentu DNA. Metodę tę opracował Kary Mullis w 1983 r. W tej technice fragment DNA do amplifikacji służy jako matryca, a enzym polimeraza DNA dodaje komplementarne nukleotydy do startera dostępnego w mieszaninie PCR. Pod koniec reakcji PCR syntetyzowanych jest wiele kopii DNA próbki.
Istnieją różne składniki mieszaniny PCR, w tym DNA, polimeraza DNA (polimeraza Taq), startery (startery do przodu i do tyłu), nukleotydy (elementy budulcowe DNA) i bufor. PCR odbywa się w maszynie do PCR i do maszyny należy załadować właściwą mieszaninę do PCR i uruchomić odpowiedni program. Technika ta umożliwia produkcję od tysięcy do milionów kopii określonej sekcji DNA z bardzo małej ilości DNA.
Reakcje PCR zachodzą cyklicznie, dając widoczną ilość produktów PCR na żelu. Istnieją trzy główne etapy reakcji PCR, a mianowicie denaturacja, przyłączanie startera i wydłużanie nici, jak pokazano na fig. 01. Te trzy etapy zachodzą w trzech różnych temperaturach. DNA istnieje w postaci dwuniciowej dzięki wiązaniom wodorowym między uzupełniającymi się zasadami. Przed implikacją dwuniciowy DNA należy oddzielić od siebie. Odbywa się to poprzez podanie wysokiej temperatury. W wysokiej temperaturze dwuniciowy DNA ulega denaturacji w pojedyncze nici. Następnie startery powinny zbliżyć się do flankujących końców określonego fragmentu lub genu DNA. Starter to krótki fragment jednoniciowego DNA, który jest komplementarny do sekwencji docelowej. Startery do przodu i do tyłu łączą się z komplementarnymi zasadami na flankujących końcach zdenaturowanego DNA próbki w temperaturze hybrydyzacji. Podkłady powinny być odporne na ciepło. Po połączeniu starterów z DNA próbki, enzym polimerazy taq inicjuje syntezę nowych nici przez dodanie nukleotydów, które są komplementarne do docelowego DNA. Polimeraza Taq jest termostabilnym enzymem izolowanym z termofilnej bakterii o nazwie Thermus aquaticus. Bufor do PCR utrzymuje optymalne warunki dla działania polimerazy taq. Te trzy etapy reakcji PCR są powtarzane w celu wytworzenia wymaganej ilości produktu PCR. Po każdej reakcji PCR liczba kopii DNA jest podwajana. W związku z tym w PCR można zaobserwować wykładniczą amplifikację. Produkty PCR można obserwować za pomocą elektroforezy żelowej i można je oczyścić do dalszych badań.
Rysunek 01: Główne etapy reakcji PCR
PCR jest cennym narzędziem w badaniach medycznych i biologicznych. PCR ma szczególną wartość w kryminalistyce, ponieważ może amplifikować DNA do badań z maleńkich próbek od przestępców i tworzyć kryminalistyczne profile DNA. PCR jest szeroko stosowany w wielu obszarach biologii molekularnej, w tym w genotypowaniu, klonowaniu genów, wykrywaniu mutacji, sekwencjonowaniu DNA, mikromacierzach DNA i testowaniu ojcostwa itp.
Rysunek 02: Reakcja łańcuchowa polimerazy
Co to jest sekwencjonowanie DNA?
Sekwencjonowanie DNA to określenie dokładnej kolejności nukleotydów - adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy w danym fragmencie DNA. Informacje genetyczne są przechowywane w sekwencjach DNA przy użyciu prawidłowej kolejności nukleotydów. Stąd znalezienie dokładnej kolejności nukleotydów we fragmencie DNA jest bardzo ważne, aby wiedzieć o strukturze i funkcji genów.
Protokół sekwencjonowania DNA obejmuje różne procesy. Pierwszym krokiem jest izolacja zainteresowanego DNA lub genomowego DNA organizmu. Stosując PCR (jak opisano powyżej), należy amplifikować żądany region DNA. Amplifikowany produkt PCR należy oddzielić przez elektroforezę żelową i oczyścić. Amplifikowane fragmenty służą jako szablony do sekwencjonowania. Sekwencjonowanie można przeprowadzić zgodnie z sekwencjonowaniem Sangera lub metodą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Sekwencjonowanie Sangera wymaga elektroforezy kapilarnej powstałych fragmentów DNA. Określenie prawidłowej kolejności nukleotydów można przeprowadzić poprzez ręczny odczyt autoradiografów lub przy użyciu automatycznych sekwencerów DNA.
Sekwencjonowanie genów przyczyniło się do projektu ludzkiego genomu i ułatwiło mapowanie ludzkiego genomu w 2003 r. W medycynie sądowej sekwencjonowanie DNA umożliwiło identyfikację osób, które wykazują unikalne sekwencje DNA i identyfikują przestępców. W medycynie sekwencjonowanie DNA można wykorzystać do wykrywania genów odpowiedzialnych za choroby genetyczne i inne, wyszukiwania genów wadliwych i zastępowania ich prawidłowymi genami. W rolnictwie informacje o sekwencjonowaniu DNA niektórych mikroorganizmów są wykorzystywane do produkcji upraw transgenicznych o ekonomicznie pożądanych cechach.
Rysunek 03: Sekwencjonowanie DNA
Jaka jest różnica między PCR a sekwencjonowaniem DNA?
Porównaj środek artykułu przed tabelą
PCR vs sekwencjonowanie DNA |
|
| Proces PCR tworzy tysiące do milionów kopii interesującego fragmentu DNA. | Sekwencjonowanie DNA to proces określania dokładnej kolejności nukleotydów w danym fragmencie DNA. |
| Wynik | |
| PCR tworzy tysiące do milionów kopii konkretnego fragmentu DNA | Powoduje to prawidłową kolejność zasad w określonym fragmencie DNA. |
| Zaangażowanie ddNTP | |
| PCR nie wymaga ddNTP. Używa dNTP. | Sekwencjonowanie DNA wymaga ddNTP do zakończenia tworzenia nici. |
Podsumowanie - PCR vs sekwencjonowanie DNA
PCR i sekwencjonowanie DNA są bardzo ważnymi narzędziami w wielu dziedzinach biologii molekularnej. Amplifikację fragmentów DNA przeprowadza się techniką PCR, a prawidłową kolejność nukleotydów fragmentu DNA określa sekwencjonowanie DNA. Na tym polega różnica między PCR a sekwencjonowaniem DNA.
