PCR vs PCR w czasie rzeczywistym
PCR, czyli reakcja łańcuchowa polimerazy, jest zrewolucjonizowanym odkryciem we współczesnej biologii molekularnej, które zostało po raz pierwszy opracowane przez chemika Kary Mullisa w 1983 r. Umożliwia amplifikację pojedynczej sekwencji w złożonym DNA do analizy. Podstawową ideą PCR jest to, że dwa startery, które są komplementarne do przeciwnych nici sekwencji DNA, są zorientowane względem siebie; startery wytwarzają komplementarne nici, z których każda zawiera drugi starter. W związku z tym wynikiem jest duża ilość sekwencji odpowiadającej DNA, który znajduje się między dwoma starterami. Enzym polimerazy DNA jest używany do wydłużania starterów w PCR. Polimeraza DNA jest enzymem termostabilnym i ma zdolność przetrwania w wysokich temperaturach (94 do 95 ° C) używanych do denaturacji matrycowego DNA.
PCR obejmuje trzy etapy, a mianowicie powtarzane rundy denaturacji, łączenie starterów i syntezę DNA. Reakcję tę przeprowadza się za pomocą termocyklera, dzięki czemu można ją zaprogramować do szybkiej i dokładnej zmiany temperatury. Zastosowania PCR to dochodzenia kryminalne, odcisk palca DNA, wykrywanie patogenów i analiza DNA wczesnych gatunków ludzkich.
Co to jest konwencjonalny PCR?
Istnieją trzy główne etapy konwencjonalnego PCR, a mianowicie; Etap amplifikacji DNA, rozdział PCR i detekcja produktów. Oddzielanie segmentów DNA odbywa się zazwyczaj za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Produkty są następnie barwione bromkiem etheiduimu. Wreszcie detekcję uzyskuje się poprzez wizualizację prążków na żelach w świetle UV. Dlatego ostateczne wyniki konwencjonalnego PCR nie są wyrażane w postaci liczb. Zwykle konwencjonalna PCR jest w stanie wykryć tylko jeden parametr.
Co to jest PCR w czasie rzeczywistym?
PCR w czasie rzeczywistym może wykryć amplifikację produktów, gdy produkty są syntetyzowane. Wraz z rozwojem technologii, PCR stała się bardzo popularną techniką, zwłaszcza do wykrywania i identyfikacji bakterii w żywności. PCR w czasie rzeczywistym wykorzystuje fluorescencyjny system barwników i termocykler wyposażony w funkcję wykrywania fluorescencji.
Jaka jest różnica między konwencjonalnym PCR a Real-time PCR?
• Konwencjonalna PCR jest bardziej czasochłonna, ponieważ wykorzystuje elektroforezę żelową do analizy amplifikowanych produktów PCR. Z kolei PCR w czasie rzeczywistym jest mniej czasochłonne, ponieważ umożliwia wykrycie amplifikacji we wczesnych fazach reakcji.
• PCR w czasie rzeczywistym zbiera dane w fazie wzrostu wykładniczego PCR, podczas gdy tradycyjny PCR zbiera dane w punkcie końcowym reakcji.
• Końcowe wyniki konwencjonalnego PCR mogą nie być bardzo dokładne, ale wyniki real-time PCR są bardzo precyzyjne.
• PCR w czasie rzeczywistym jest bardziej czuły niż konwencjonalny PCR.
• Konwencjonalny PCR ma bardzo słabą rozdzielczość, podczas gdy PCR w czasie rzeczywistym może wykryć bardzo małe zmiany ze względu na wysoką rozdzielczość.
• Detekcja punktu końcowego w konwencjonalnej technice PCR ma krótki zakres dynamiczny, podczas gdy detekcja PCR w czasie rzeczywistym ma szeroki zakres dynamiczny.
• W przeciwieństwie do konwencjonalnego PCR, zautomatyzowane techniki wykrywania są stosowane w czasie rzeczywistym PCR.
• Konwencjonalny PCR jest wysoce wyrafinowany i pracochłonny bardziej niż PCR w czasie rzeczywistym.
• W przeciwieństwie do PCR w czasie rzeczywistym, konwencjonalna PCR nie pozwala na rozróżnienie pomiędzy martwymi i żywymi bakteriami.
• PCR w czasie rzeczywistym wykorzystuje system barwników fluorescencyjnych do wykrywania produktów, podczas gdy konwencjonalna PCR wykorzystuje bromek etydyny i światło UV do wizualizacji prążków na podłożu z żelu agarozowego.
