Różnica Między Northern Southern I Western Blotting

2024 Autor: Mildred Bawerman | [email protected]. Ostatnio zmodyfikowany: 2023-12-16 08:41

Kluczowa różnica - Northern vs Southern vs Western Blotting

Wykrywanie określonych sekwencji DNA, RNA i białek ma zasadnicze znaczenie dla różnego rodzaju badań z zakresu biologii molekularnej. Elektroforeza żelowa to technika polegająca na oddzieleniu DNA, RNA i białek według ich wielkości. Z profili żelowych, określoną sekwencję DNA, sekwencję RNA lub białko wykrywa się specjalnymi technikami zwanymi blottingiem i hybrydyzacją ze znakowanymi sondami. Istnieją trzy różne rodzaje metod blottingu: południowa, północna i zachodnia. Kluczowa różnica między Northern i Western blotting polega na typie cząsteczki wykrywanej w próbce. Southern blotting to metoda polegająca na wykrywaniu określonej sekwencji DNA z próbki DNA. Northern blotting to technika, która wykrywa określoną sekwencję RNA z próbki RNA. Western blot to metoda, która wykrywa określone białko w próbce białka.

SPIS TREŚCI

1. Przegląd i kluczowe różnice

2. Co to jest Southern Blotting

3. Co to jest Northern Blotting

4. Co to jest Western Blotting

5. Porównanie bezpośrednie - Northern vs Southern vs Western Blotting

6. Podsumowanie

Co to jest Southern Blotting?

Technika Southern blot została opracowana przez EM Southern w 1975 roku w celu identyfikacji określonej sekwencji DNA z próbki DNA. Jest to pierwsza technika blottingu wprowadzona w biologii molekularnej. Umożliwił on wykrycie określonych genów z DNA, określonych fragmentów DNA itp. Technika Southern blot obejmuje kilka etapów. Są one następujące.

1. DNA jest izolowane z próbki i trawione endonukleazami restrykcyjnymi.
2. Strawioną próbkę oddziela się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
3. Fragmenty DNA w żelu są denaturowane do postaci pojedynczych nici przy użyciu roztworu alkalicznego.
4. Jednoniciowy DNA jest przenoszony na nitrocelulozową membranę filtracyjną przez przenoszenie kapilarne.
5. Przeniesiony DNA jest trwale mocowany na błonie.
6. Utrwalony DNA na błonie jest hybrydyzowany ze znakowanymi sondami.
7. Niezwiązane DNA jest wymywane z błony przez przemywanie.
8. Film rentgenowski naświetla się na błonę i przygotowuje autoradiografię.

Metoda Southern blotting jest stosowana w różnych aspektach biologii molekularnej. Jest przydatny w mapowaniu RFLP, badaniach kryminalistycznych, metylacji DNA w ekspresji genów, wykrywaniu zmutowanych genów w chorobach genetycznych, odciskach palców DNA itp.

Rysunek 01: Technika Southern Blotting

Co to jest Northern Blotting?

Northern blotting to metoda zaprojektowana do wykrywania określonej sekwencji RNA lub sekwencji mRNA z próbki w celu zbadania ekspresji genów. Technika ta została opracowana przez Alwine'a, Kempa i Starka w 1979 roku. Różni się ona od technik Sourthern i Western blotting kilkoma krokami. Jednak ta technika jest również wykonywana poprzez elektroforezę żelową, blotting i hybrydyzację ze specyficznymi znakowanymi sondami i detekcją. Technikę Northern blotting przeprowadza się w następujący sposób.

1. RNA ekstrahuje się z próbki i rozdziela metodą elektroforezy żelowej.
2. RNA jest przenoszone z żelu na membranę do blottingu i utrwalane.
3. Membrana jest traktowana znakowaną sondą przygotowaną z cDNA lub RNA (sonda jest komplementarna do określonej sekwencji w próbce).
4. Sondę inkubuje się z membraną w celu związania z określoną sekwencją.
5. Niezwiązane sondy są wymywane.
6. Fragmenty zhybrydyzowane są wykrywane przez autoradiograf.

Northern blotting jest ważnym narzędziem do wykrywania i kwantyfikacji zhybrydyzowanego mRNA, badania degradacji RNA, oceny czasu półtrwania RNA, wykrywania splicingu RNA, badania ekspresji genów itp.

Rysunek 02: Northern blotting

Co to jest Western Blotting?

Western blot to metoda wykrywania określonego białka z mieszaniny białek przy użyciu znakowanego przeciwciała. Dlatego western blot jest również znany jako immunoblot. Technika ta została wprowadzona przez Towbina i wsp. W 1979 roku i jest obecnie rutynowo wykonywana w laboratoriach do analizy białek. Kroki są następujące.

1. Białka są ekstrahowane z próbki
2. Białka rozdziela się na podstawie ich wielkości przy użyciu elektroforezy na żelu poliakrylamidowym
3. Oddzielone cząsteczki przenosi się na membranę PVDF lub membranę nitrocelulozową przez elektroporację
4. Membrana jest zablokowana pod kątem niespecyficznego wiązania z przeciwciałami
5. Przeniesione białka są wiązane przez przeciwciało pierwotne (przeciwciała znakowane enzymatycznie).
6. Membranę przemywa się, aby usunąć niespecyficznie związane pierwotne przeciwciała
7. Związane przeciwciała są wykrywane przez dodanie substratu i wykrywanie utworzonego kolorowego osadu

Analiza Western blot jest przydatna w wykrywaniu przeciwciał anty-HIV w próbce ludzkiej surowicy. Western blot może być również stosowany jako test potwierdzający zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B i ostateczny test w kierunku choroby szalonych krów.

Rysunek 03: Western Blotting

Jaka jest różnica między Northern Southern i Western Blotting?

Porównaj środek artykułu przed tabelą

Northern vs Southern vs Western Blotting
Typ wykrytej cząsteczki
Northern Blotting	Metoda Northern blot wykrywa określoną sekwencję RNA z próbki RNA.
Southern Blotting	Metoda Southern blot wykrywa określoną sekwencję DNA z próbki DNA.
Western Blotting	Western blot wykrywa określone białko z próbki białka.
Rodzaj żelu
Northern Blotting	To wykorzystuje żel agarozowo-formaldehydowy.
Southern Blotting	Wykorzystuje żel agarozowy.
Western Blotting	To wykorzystuje żel poliakrylamidowy.
Metoda blottingu
Northern Blotting	To jest transfer kapilarny.
Southern Blotting	To jest transfer kapilarny.
Western Blotting	To jest transfer elektryczny.
Używane sondy
Northern Blotting	Sondy cDNA lub RNA znakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie.
Southern Blotting	Sondy DNA są znakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie.
Western Blotting	Pierwotne przeciwciała są używane jako sondy.
System wykrywania
Northern Blotting	Odbywa się to za pomocą autoradiografu lub wykrywania zmiany światła lub koloru.
Southern Blotting	Odbywa się to za pomocą autoradiografu, wykrywania zmiany światła lub koloru.
Western Blotting	Odbywa się to za pomocą wykrywania zmiany światła lub koloru.

Podsumowanie - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting to specjalna technika opracowana w celu identyfikacji określonego DNA, RNA lub białka z próbek. Istnieją trzy oddzielne procedury blottingu: północna, południowa i zachodnia, w celu wykrycia określonego typu cząsteczki. Technika blottingu typu Northern jest przeznaczona do wykrywania określonej sekwencji RNA z mieszaniny RNA. Technika Southern blot umożliwia wykrycie określonej sekwencji DNA z próbki DNA, a technika western blot została opracowana w celu identyfikacji określonego białka z mieszaniny białek.