Kluczowa różnica - Northern vs Southern vs Western Blotting
Wykrywanie określonych sekwencji DNA, RNA i białek ma zasadnicze znaczenie dla różnego rodzaju badań z zakresu biologii molekularnej. Elektroforeza żelowa to technika polegająca na oddzieleniu DNA, RNA i białek według ich wielkości. Z profili żelowych, określoną sekwencję DNA, sekwencję RNA lub białko wykrywa się specjalnymi technikami zwanymi blottingiem i hybrydyzacją ze znakowanymi sondami. Istnieją trzy różne rodzaje metod blottingu: południowa, północna i zachodnia. Kluczowa różnica między Northern i Western blotting polega na typie cząsteczki wykrywanej w próbce. Southern blotting to metoda polegająca na wykrywaniu określonej sekwencji DNA z próbki DNA. Northern blotting to technika, która wykrywa określoną sekwencję RNA z próbki RNA. Western blot to metoda, która wykrywa określone białko w próbce białka.
SPIS TREŚCI
1. Przegląd i kluczowe różnice
2. Co to jest Southern Blotting
3. Co to jest Northern Blotting
4. Co to jest Western Blotting
5. Porównanie bezpośrednie - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Podsumowanie
Co to jest Southern Blotting?
Technika Southern blot została opracowana przez EM Southern w 1975 roku w celu identyfikacji określonej sekwencji DNA z próbki DNA. Jest to pierwsza technika blottingu wprowadzona w biologii molekularnej. Umożliwił on wykrycie określonych genów z DNA, określonych fragmentów DNA itp. Technika Southern blot obejmuje kilka etapów. Są one następujące.
- DNA jest izolowane z próbki i trawione endonukleazami restrykcyjnymi.
- Strawioną próbkę oddziela się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
- Fragmenty DNA w żelu są denaturowane do postaci pojedynczych nici przy użyciu roztworu alkalicznego.
- Jednoniciowy DNA jest przenoszony na nitrocelulozową membranę filtracyjną przez przenoszenie kapilarne.
- Przeniesiony DNA jest trwale mocowany na błonie.
- Utrwalony DNA na błonie jest hybrydyzowany ze znakowanymi sondami.
- Niezwiązane DNA jest wymywane z błony przez przemywanie.
- Film rentgenowski naświetla się na błonę i przygotowuje autoradiografię.
Metoda Southern blotting jest stosowana w różnych aspektach biologii molekularnej. Jest przydatny w mapowaniu RFLP, badaniach kryminalistycznych, metylacji DNA w ekspresji genów, wykrywaniu zmutowanych genów w chorobach genetycznych, odciskach palców DNA itp.
Rysunek 01: Technika Southern Blotting
Co to jest Northern Blotting?
Northern blotting to metoda zaprojektowana do wykrywania określonej sekwencji RNA lub sekwencji mRNA z próbki w celu zbadania ekspresji genów. Technika ta została opracowana przez Alwine'a, Kempa i Starka w 1979 roku. Różni się ona od technik Sourthern i Western blotting kilkoma krokami. Jednak ta technika jest również wykonywana poprzez elektroforezę żelową, blotting i hybrydyzację ze specyficznymi znakowanymi sondami i detekcją. Technikę Northern blotting przeprowadza się w następujący sposób.
- RNA ekstrahuje się z próbki i rozdziela metodą elektroforezy żelowej.
- RNA jest przenoszone z żelu na membranę do blottingu i utrwalane.
- Membrana jest traktowana znakowaną sondą przygotowaną z cDNA lub RNA (sonda jest komplementarna do określonej sekwencji w próbce).
- Sondę inkubuje się z membraną w celu związania z określoną sekwencją.
- Niezwiązane sondy są wymywane.
- Fragmenty zhybrydyzowane są wykrywane przez autoradiograf.
Northern blotting jest ważnym narzędziem do wykrywania i kwantyfikacji zhybrydyzowanego mRNA, badania degradacji RNA, oceny czasu półtrwania RNA, wykrywania splicingu RNA, badania ekspresji genów itp.
Rysunek 02: Northern blotting
Co to jest Western Blotting?
Western blot to metoda wykrywania określonego białka z mieszaniny białek przy użyciu znakowanego przeciwciała. Dlatego western blot jest również znany jako immunoblot. Technika ta została wprowadzona przez Towbina i wsp. W 1979 roku i jest obecnie rutynowo wykonywana w laboratoriach do analizy białek. Kroki są następujące.
- Białka są ekstrahowane z próbki
- Białka rozdziela się na podstawie ich wielkości przy użyciu elektroforezy na żelu poliakrylamidowym
- Oddzielone cząsteczki przenosi się na membranę PVDF lub membranę nitrocelulozową przez elektroporację
- Membrana jest zablokowana pod kątem niespecyficznego wiązania z przeciwciałami
- Przeniesione białka są wiązane przez przeciwciało pierwotne (przeciwciała znakowane enzymatycznie).
- Membranę przemywa się, aby usunąć niespecyficznie związane pierwotne przeciwciała
- Związane przeciwciała są wykrywane przez dodanie substratu i wykrywanie utworzonego kolorowego osadu
Analiza Western blot jest przydatna w wykrywaniu przeciwciał anty-HIV w próbce ludzkiej surowicy. Western blot może być również stosowany jako test potwierdzający zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B i ostateczny test w kierunku choroby szalonych krów.
Rysunek 03: Western Blotting
Jaka jest różnica między Northern Southern i Western Blotting?
Porównaj środek artykułu przed tabelą
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Typ wykrytej cząsteczki | |
| Northern Blotting | Metoda Northern blot wykrywa określoną sekwencję RNA z próbki RNA. |
| Southern Blotting | Metoda Southern blot wykrywa określoną sekwencję DNA z próbki DNA. |
| Western Blotting | Western blot wykrywa określone białko z próbki białka. |
| Rodzaj żelu | |
| Northern Blotting | To wykorzystuje żel agarozowo-formaldehydowy. |
| Southern Blotting | Wykorzystuje żel agarozowy. |
| Western Blotting | To wykorzystuje żel poliakrylamidowy. |
| Metoda blottingu | |
| Northern Blotting | To jest transfer kapilarny. |
| Southern Blotting | To jest transfer kapilarny. |
| Western Blotting | To jest transfer elektryczny. |
| Używane sondy | |
| Northern Blotting | Sondy cDNA lub RNA znakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie. |
| Southern Blotting | Sondy DNA są znakowane radioaktywnie lub nieradioaktywnie. |
| Western Blotting | Pierwotne przeciwciała są używane jako sondy. |
| System wykrywania | |
| Northern Blotting | Odbywa się to za pomocą autoradiografu lub wykrywania zmiany światła lub koloru. |
| Southern Blotting | Odbywa się to za pomocą autoradiografu, wykrywania zmiany światła lub koloru. |
| Western Blotting | Odbywa się to za pomocą wykrywania zmiany światła lub koloru. |
Podsumowanie - Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting to specjalna technika opracowana w celu identyfikacji określonego DNA, RNA lub białka z próbek. Istnieją trzy oddzielne procedury blottingu: północna, południowa i zachodnia, w celu wykrycia określonego typu cząsteczki. Technika blottingu typu Northern jest przeznaczona do wykrywania określonej sekwencji RNA z mieszaniny RNA. Technika Southern blot umożliwia wykrycie określonej sekwencji DNA z próbki DNA, a technika western blot została opracowana w celu identyfikacji określonego białka z mieszaniny białek.
