Kluczowa różnica - klonowanie a subklonowanie
Klonowanie i subklonowanie to procedury biologii molekularnej, które tworzą genetycznie identyczne komórki lub organizmy posiadające DNA lub gen będący przedmiotem zainteresowania. Klonowanie to technika polegająca na wstawieniu interesującego genu lub DNA do wektora, jego replikacji w bakteriach gospodarza i produkcji komórek lub organizmów, które są dokładnymi kopiami składu genetycznego. Subklonowanie to technika polegająca na wstawieniu interesującego genu, który jest już wstawiony do wektora, do wektora wtórnego, jego replikacji w bakterii gospodarza i wytworzeniu identycznych genetycznie kopii komórek lub organizmów. Kluczowa różnica między klonowaniem a subklonowaniem polega na tym, że podczas klonowania interesujący gen po zligowaniu z wektorem kontynuuje proces klonowania, podczas gdy w ramach subklonowania,już sklonowany gen będący przedmiotem zainteresowania oddziela się od wektora macierzystego i ponownie wstawia do wektora biorcy i kontynuuje proces.
SPIS TREŚCI
1. Omówienie i kluczowe różnice
2. Czym jest klonowanie
3. Co to jest subklonowanie
4. Bezpośrednie porównanie - klonowanie a subklonowanie
5. Podsumowanie
Co to jest klonowanie?
Klonowanie to procedura, która daje genetycznie identyczne organizmy lub komórki. W naturze klonowanie odbywa się w drodze rozmnażania bezpłciowego. Gdy nie ma rekombinacji lub zmiany genetycznej, komórki potomne otrzymują taki sam skład genetyczny jak rodzic. Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne tworzą klony przez rozszczepienie binarne, pączkowanie, mitozę itp. W biologii molekularnej klonowanie genów lub określonych fragmentów DNA jest popularną metodą badania struktury i funkcji tej konkretnej sekcji DNA.
Głównym celem klonowania molekularnego jest wykonanie milionów kopii identycznych genetycznie komórek lub organizmów zawierających interesujący fragment DNA (głównie geny). Tworzy organizmy z dokładnymi kopiami genetycznymi innego. Przede wszystkim specyficzne geny są klonowane w badaniach molekularnych w celu uzyskania informacji strukturalnych i funkcjonalnych oraz do sekwencjonowania DNA. Klonowanie jest również szeroko stosowane do produkcji określonych białek lub produktów na dużą skalę.
Procedura klonowania
Podstawowe kroki procedury klonowania są następujące.
- Identyfikacja i izolacja interesującego genu. (Amplifikacja genu będącego przedmiotem zainteresowania metodą PCR).
- Trawienie restrykcyjne interesującego genu (endonukleaza restrykcyjna przecina gen).
- Trawienie restrykcyjne DNA wektora. (DNA wektora jest również cięte przy użyciu tej samej endonukleazy restrykcyjnej).
- Wstawienie genu do wektora i utworzenie rekombinowanej cząsteczki.
- Transformacja rekombinowanego wektora do bakterii gospodarza.
- Izolacja i identyfikacja transformowanych bakterii (wektor plazmidowy powinien zawierać selekcyjny gen, najczęściej gen oporności na antybiotyki do przeszukiwania transformowanych bakterii).
- Ekspresja rekombinowanych genów w gospodarzu.
Rysunek_01: Procedura klonowania
Co to jest subklonowanie?
Subklonowanie to procedura przenoszenia genu będącego przedmiotem zainteresowania z jednego wektora do innego w celu sprawdzenia ekspresji genu w celu uzyskania pożądanej funkcjonalności genu. W tej metodzie zaangażowane są dwa wektory; mianowicie wektor macierzysty i wektor docelowy. Sklonowane wstawki są ponownie przenoszone do drugiego wektora podczas subklonowania. Celem przeniesienia genu z pierwszego wektora do drugiego wektora jest uzyskanie czegoś, czego nie mógłby dokonać pierwszy wektor lub ponowne oddzielenie genu w już sklonowanym fragmencie DNA i jego samodzielna ekspresja. Na początku tej procedury stosuje się enzymy restrykcyjne.
Procedura subklonowania
Podstawowe kroki subklonowania są następujące.
- Za pomocą endonukleaz restrykcyjnych, oddzielenie DNA będącego przedmiotem zainteresowania w plazmidzie dawcy (wektorze macierzystym).
- Amplifikacja DNA będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą PCR.
- Oczyszczanie produktu PCR (DNA będącego przedmiotem zainteresowania) za pomocą elektroforezy żelowej.
- Otwarcie plazmidu biorcy przez te same endonukleazy restrykcyjne, które zastosowano do oddzielenia DNA będącego przedmiotem zainteresowania w plazmidzie macierzystym.
- Ligacja DNA będącego przedmiotem zainteresowania (genu) do plazmidu biorcy w celu utworzenia subklonowanego plazmidu.
- Transformacja subklonowanego wektora do kompetentnej bakterii gospodarza.
- Badania przesiewowe transformowanych komórek.
- Oczyszczanie plazmidowego DNA i zastosowanie do sekwencjonowania DNA lub ekspresji genów w celu uzyskania pożądanych produktów.
Subklonowanie przeprowadza się przy okazji izolowania jednego genu ze sklonowanej grupy genów lub gdy wymagany jest gen będący przedmiotem zainteresowania, aby przenieść go do użytecznego plazmidu, aby zobaczyć dokładną funkcję interesującego genu.
Rysunek_02: Procedura subklonowania
Jaka jest różnica między klonowaniem a subklonowaniem?
Porównaj środek artykułu przed tabelą
Klonowanie a podklonowanie |
|
| Klonowanie to procedura, która daje genetycznie identyczne organizmy lub komórki. | Subklonowanie to procedura przenoszenia genu będącego przedmiotem zainteresowania z jednego wektora do innego w celu sprawdzenia ekspresji genu w celu uzyskania pożądanej funkcjonalności genu. |
| Proces | |
| Oddziel interesujące DNA od organizmu i raz wstaw do wektora i sklonuj | Już sklonowany DNA jest oddzielany od pierwszego wektora i wstawiany do drugiego wektora i klonowany. |
| Wstaw ruch za pomocą wektorów | |
| Nie przenosi wstawek (DNA będącego przedmiotem zainteresowania) z jednego wektora do drugiego. | Przenieś inserty z wektora macierzystego do wektora docelowego. |
Podsumowanie - klonowanie a subklonowanie
Klonowanie tworzy genetycznie identyczne komórki lub organizmy z wstawionym genem lub interesującym nas DNA. Postępuje poprzez separację i wstawienie interesującego DNA do wektora i ekspresję w bakterii gospodarza. Subklonowanie przebiega podobnie jak klonowanie. Jednak podczas subklonowania, już sklonowany fragment DNA (gen będący przedmiotem zainteresowania) jest wstawiany do wektora i transformowany do bakterii gospodarza. To jest kluczowa różnica między klonowaniem a subklonowaniem.
