Kluczowa różnica - sekwencjonowanie mikromacierzy a sekwencjonowanie RNA
Transkryptom reprezentuje całą zawartość RNA obecnego w komórce, w tym mRNA, rRNA, tRNA, zdegradowany RNA i niezdegradowany RNA. Profilowanie transkryptomu jest ważnym procesem umożliwiającym zrozumienie spostrzeżeń dotyczących komórki. Istnieje kilka zaawansowanych metod profilowania transkryptomu. Sekwencjonowanie mikromacierzy i RNA to dwa rodzaje technologii opracowanych do analizy transkryptomu. Kluczową różnicą między sekwencjonowaniem mikromacierzy a sekwencjonowaniem RNA jest to, że mikromacierz opiera się na potencjale hybrydyzacyjnym wstępnie zaprojektowanych znakowanych sond z docelowymi sekwencjami cDNA, podczas gdy sekwencjonowanie RNA opiera się na bezpośrednim sekwencjonowaniu nici cDNA za pomocą zaawansowanych technik sekwencjonowania, takich jak NGS. Mikromacierz jest wykonywana z wcześniejszą wiedzą o sekwencjach, a sekwencjonowanie RNA jest wykonywane bez wcześniejszej wiedzy o sekwencjach.
SPIS TREŚCI
1. Omówienie i kluczowe różnice
2. Co to jest mikromacierz
3. Co to jest sekwencjonowanie RNA
4. Porównanie obok siebie - sekwencjonowanie mikromacierzy i RNA
5. Podsumowanie
Co to jest Microarray?
Mikromacierz to solidna, niezawodna i wysokoprzepustowa metoda stosowana przez naukowców do profilowania transkryptomu. Jest to najpopularniejsza metoda analizy transkrypcji. Jest to metoda tania, która zależy od sond hybrydyzacyjnych.
Technika rozpoczyna się od ekstrakcji mRNA z próbki i konstrukcji biblioteki cDNA z całkowitego RNA. Następnie jest mieszany z wstępnie zaprojektowanymi sondami znakowanymi fluorescencyjnie na stałej powierzchni (matryca punktowa). Komplementarne sekwencje hybrydyzują ze znakowanymi sondami w mikromacierzy. Następnie mikromacierz jest przemywana i przesiewana, a obraz jest określany ilościowo. Zebrane dane należy przeanalizować, aby uzyskać względne profile ekspresji.
Zakłada się, że intensywność sond mikromacierzy jest proporcjonalna do ilości transkryptów w próbce. Jednak dokładność techniki zależy od zaprojektowanych sond, wcześniejszej wiedzy o sekwencji i powinowactwa sond do hybrydyzacji. Dlatego technologia mikromacierzy ma ograniczenia. Techniki mikromacierzy nie można przeprowadzić z transkryptami o małej liczebności. Nie rozróżnia izoform i nie identyfikuje wariantów genetycznych. Ponieważ ta metoda zależy od hybrydyzacji sond, pewne problemy związane z hybrydyzacją, takie jak hybrydyzacja krzyżowa, hybrydyzacja niespecyficzna itp. Występują w technice mikromacierzy.
Rysunek 01: Mikromacierz
Co to jest sekwencjonowanie RNA?
Sekwencjonowanie RNA shotgun (sekwencja RNA) jest niedawno opracowaną techniką sekwencjonowania całego transkryptomu. Jest to szybka i wysokoprzepustowa metoda profilowania transkryptomu. Bezpośrednio określa ilościowo ekspresję genów i prowadzi do dogłębnych badań transkryptomu. Sekwencja RNA nie zależy od wcześniej zaprojektowanych sond lub wcześniejszej wiedzy o sekwencjach. Dlatego metoda RNA seq ma wysoką czułość i zdolność wykrywania nowych genów i wariantów genetycznych.
Metoda sekwencjonowania RNA przebiega w kilku etapach. Całkowity RNA komórki musi zostać wyizolowany i podzielony na fragmenty. Następnie przy użyciu odwrotnej transkryptazy należy przygotować bibliotekę cDNA. Każda nić cDNA musi być zligowana z adapterami. Następnie zligowane fragmenty muszą zostać amplifikowane i oczyszczone. Wreszcie, stosując metodę NGS, należy przeprowadzić sekwencjonowanie cDNA.
Rysunek 02: Sekwencjonowanie RNA
Jaka jest różnica między sekwencjonowaniem Microarray a RNA?
Porównaj środek artykułu przed tabelą
Sekwencjonowanie mikromacierzy vs RNA |
|
| Mikromacierz to solidna, niezawodna metoda o dużej przepustowości. | Sekwencjonowanie RNA to dokładna i wysokoprzepustowa metoda. |
| Koszt | |
| Jest to metoda tania. | To droga metoda. |
| Analiza dużej liczby próbek | |
| Ułatwia to jednoczesną analizę dużej liczby próbek. | Ułatwia to analizę dużej liczby próbek. |
| Analiza danych | |
| Analiza danych jest złożona. | W tej metodzie generowanych jest więcej danych; stąd proces jest bardziej złożony. |
| Wcześniejsza znajomość sekwencji | |
| Ta metoda jest oparta na sondach hybrydyzacyjnych, więc wymagana jest wcześniejsza znajomość sekwencji. | Ta metoda nie zależy od wcześniejszej znajomości sekwencji. |
| Strukturalne wariacje i nowe geny | |
| Ta metoda nie pozwala wykryć zmian strukturalnych i nowych genów. | Ta metoda może wykrywać zmiany strukturalne, takie jak łączenie genów, alternatywny splicing i nowe geny. |
| Wrażliwość | |
| To nie może wykryć różnic w ekspresji izoform, więc ma ograniczoną czułość. | Ma to wysoką czułość. |
| Wynik | |
| Może to skutkować jedynie względnymi poziomami ekspresji. Nie daje to absolutnej ilościowej oceny ekspresji genów. | Daje bezwzględne i względne poziomy ekspresji. |
| Ponowna analiza danych | |
| Należy to powtórzyć w celu ponownej analizy. | Dane sekwencjonowania można ponownie przeanalizować. |
| Potrzeba określonego personelu i infrastruktury | |
| W przypadku mikromacierzy nie jest wymagana specjalna infrastruktura i personel. | Specyficzna infrastruktura i personel wymagany do sekwencjonowania RNA. |
| Problemy techniczne | |
| Technika mikromacierzy wiąże się z problemami technicznymi, takimi jak hybrydyzacja krzyżowa, hybrydyzacja niespecyficzna, ograniczona szybkość wykrywania pojedynczych sond itp. | Technika sekwencji RNA pozwala uniknąć problemów technicznych, takich jak hybrydyzacja krzyżowa, hybrydyzacja niespecyficzna, ograniczona szybkość wykrywania pojedynczych sond itp. |
| Uprzedzenia | |
| Jest to metoda tendencyjna, ponieważ zależy od hybrydyzacji. | Odchylenie jest niskie w porównaniu do mikromacierzy. |
Podsumowanie - sekwencjonowanie mikromacierzy a sekwencjonowanie RNA
Metody sekwencjonowania mikromacierzy i RNA to wysokowydajne platformy opracowane do profilowania transkryptomu. Obie metody dają wyniki, które są silnie skorelowane z profilami ekspresji genów. Jednak sekwencjonowanie RNA ma przewagę nad mikromacierzami w analizie ekspresji genów. Sekwencjonowanie RNA jest bardziej czułą metodą wykrywania transkryptów o małej liczebności niż mikromacierze. Sekwencjonowanie RNA umożliwia także różnicowanie izoform i identyfikację wariantów genów. Jednak większość badaczy wybiera mikromacierz, ponieważ sekwencjonowanie RNA jest nową i kosztowną techniką, wymagającą przechowywania danych i złożonej analizy danych.
