Kluczowa różnica - startery PCR a startery sekwencjonujące
Wraz z ostatnimi osiągnięciami w dziedzinie biologii molekularnej opracowano różne techniki genetyczne, które sprawiły, że procesy badawcze na różnych kierunkach były łatwe i dokładne. PCR i inne procedury sekwencjonowania to dwie ważne takie techniki. Używają różnych podskładników. Startery są uważane za główny komponent wspólny dla obu technik PCR i sekwencjonowania. Startery do PCR są używane do amplifikacji określonej sekwencji DNA, podczas gdy startery do sekwencjonowania są używane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA w celu ujawnienia jego określonej kolejności sekwencji nukleotydów. To jest kluczowa różnica między starterami PCR a starterami do sekwencjonowania.
ZAWARTOŚĆ
1. Przegląd i kluczowe różnice
2. Co to są startery do PCR
3. Co to są startery do sekwencjonowania
4. Podobieństwa między starterami do PCR i starterami do sekwencjonowania
5. Porównanie obok siebie - startery PCR a startery do sekwencjonowania w formie tabelarycznej
6. Podsumowanie
Co to są startery do PCR?
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to technika genetyczna wykorzystywana w dziedzinie biologii molekularnej do amplifikacji jednej lub kilku kopii określonego segmentu DNA i uzyskania wielu milionów identycznych kopii. W reakcji PCR używane są różne składniki, w tym startery. Startery to krótkie nici DNA o długości nukleotydów 18-25, co czyni je kompatybilnymi z regionem początkowym i końcowym fragmentów DNA, które mają być amplifikowane. Startery mogą być starterem do przodu i starterem do tyłu. Te startery wiążą się z fragmentem DNA w określonych punktach, w których powoduje, że polimeraza DNA wiąże się ze specyficznym starterem w tym miejscu i inicjuje syntezę nowej nici DNA.
Dobór starterów jest ważnym aspektem procesu PCR. Ważny jest dobór długości podkładu. Idealna długość to 18-25 nukleotydów. Jeśli długość jest zbyt krótka lub zbyt długa, startery nie będą wiązać się z sekwencją DNA, która ma być dokładnie amplifikowana. Startery o zbyt krótkiej długości prowadzą do niespecyficznej hybrydyzacji starterów w różnych miejscach sekwencji DNA.
Rysunek 01: Startery PCR
Zawartość guaniny i cytozyny (GC) w dobrym podkładzie powinna wynosić 40-60. Temperatura wyżarzania startera i temperatura topnienia są istotnymi czynnikami podczas PCR. Temperatura topnienia powinna być dokładnie obliczona, a temperatura wyżarzania podkładu powinna być o 5 0 C niższa od temperatury topnienia. Temperatura topnienia powinna wynosić 60 ° C i 75 ° C. Zbyt wysokie lub zbyt niskie temperatury spowodują mniej aktywną aktywność polimerazy DNA.
Co to są startery sekwencyjne?
Startery do sekwencjonowania są używane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA w celu ujawnienia jego specyficznej tożsamości. Aby uzyskać dobre wyniki sekwencjonowania, ważne są wysokiej jakości startery i matryce. Tak więc, kiedy wybierane są startery, powinny one być unikalne dla określonego regionu, w którym chcemy sekwencjonować. Powinien również mieć prawidłową orientację, w której sekwencje są zwykle generowane z końców 3 'do 5' starterów. Sekwencja powinna być pozbawiona niepożądanej hybrydyzacji własnej, takiej jak tworzenie pętli typu spinki do włosów. Nie powinien zawierać kolejnych formacji zasad guaniny.
Temperatura topnienia (Tm) podkładu musi być odpowiednia do warunków sekwencjonowania. Dlatego powinna mieścić się w przedziale od 52 o C do 74 o C. Przygotowanie oligonukleotydów do stosowania jako starter powinno być oczyszczone w celu uzyskania pożądanej pełnej długości sekwencji. Jeśli oligonukleotydy zawierają zanieczyszczenia, sygnalizacja sekwencji startera zostanie nałożona z różnych miejsc starterów, a także zmniejszy liczbę komórek podstawowych.
Rysunek 02: Sekwencjonowanie starterów
Temperatura topnienia startera (Tm) oligonukleotydu określa, jak silne są ze sobą hybrydyzujące komplementarne nici DNA. Tm można uznać za obliczenie termodynamiczne, w którym jest ono zależne zarówno od sekwencji DNA, jak i kilku warunków, takich jak stężenie soli. Tm jest ważne podczas PCR, w którym wariant zwany sekwencjonowaniem cyklicznym jest używany do wytworzenia grupy fragmentów zakończonych dideoksynukleotydem. Tutaj sekwencjonowany starter będzie początkowo alternatywnie przyłączany do sieci, następnie wydłużany i na koniec denaturowany w celu amplifikacji. Dlatego wartość Tm powinna zawierać się w przedziale od 52 o C do 74 oC. Zsyntetyzowane oligonukleotydy można uzyskać z laboratoriów syntezy DNA / RNA według wyboru. Mała skala syntezy wykorzystywana do sekwencjonowania DNA wynosi zwykle 50 nmol. Co najważniejsze, startery używane do sekwencjonowania powinny być oczyszczone, aby były wolne od zanieczyszczeń, które zapobiegną pogorszeniu jakości.
Jakie są podobieństwa między starterami do PCR a starterami do sekwencjonowania?
- Zarówno startery PCR, jak i startery do sekwencjonowania są starterami używanymi w procesie amplifikacji docelowej sekwencji DNA.
- Zarówno startery PCR, jak i startery do sekwencjonowania składają się z nukleotydów.
- Zarówno startery PCR, jak i startery do sekwencjonowania są krótkimi oligomerami.
Jaka jest różnica między starterami do PCR a starterami do sekwencjonowania?
Porównaj środek artykułu przed tabelą
Startery do PCR a startery do sekwencjonowania |
|
| Startery do PCR to krótkie nici DNA o długości sekwencji nukleotydów 18-25, co czyni je kompatybilnymi z regionem początkowym i końcowym fragmentów DNA, które mają być amplifikowane. | Startery do sekwencjonowania to krótkie oligomery, które są używane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA w celu ujawnienia jego specyficznej tożsamości. |
| Funkcjonować | |
| Startery PCR są używane do amplifikacji określonej sekwencji DNA. | Startery do sekwencjonowania są używane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA w celu ujawnienia jego specyficznej tożsamości. |
| Liczba potrzebnych starterów | |
| Dwa startery; jeden starter lewy i jeden starter prawy są używane jako startery PCR. | Potrzebujesz tylko jednego startera jako startera do sekwencjonowania. |
Podsumowanie - startery PCR vs startery sekwencjonujące
Startery do sekwencjonowania są używane w kontekście sekwencjonowania fragmentu DNA w celu ujawnienia jego specyficznej tożsamości. Do uruchomienia procesu wystarczy jeden starter do sekwencjonowania. Aby uzyskać dobre wyniki sekwencjonowania, ważne są wysokiej jakości startery i szablony. Tak więc, kiedy wybierane są startery, powinny one być unikalne dla określonego regionu, w którym chcemy sekwencjonować. Startery PCR to krótkie nici DNA o długości nukleotydów 18–25, które są zgodne z regionem początkowym i końcowym fragmentów DNA, które mają być amplifikowane. Startery do PCR mogą być starterami do przodu i do tyłu. Zawartość guaniny i cytozyny (GC) w dobrym podkładzie powinna wynosić 40-60. Temperatura wyżarzania startera i temperatura topnienia są istotnymi aspektami podczas PCR. To jest różnica między starterami do PCR a starterami do sekwencjonowania.
