Kluczowa różnica między helikazą a topoizomerazą polega na tym, że helikaza jest enzymem, który oddziela dwie komplementarne nici DNA przez zerwanie wiązań wodorowych między zasadami dwóch nici, podczas gdy topoizomeraza jest enzymem, który usuwa dodatnie i ujemne superswoje powstałe podczas rozwijania DNA przez cięcie i ponowne uszczelnienie jednej lub obu nici dupleksu DNA.
DNA to podwójna helisa. Występuje w dwóch komplementarnych niciach połączonych ze sobą wiązaniami wodorowymi. Replikacja DNA, transkrypcja i naprawa DNA wymagają oddzielenia dwóch nici od siebie w celu wykonania nowych kopii, wytworzenia mRNA i dodania nukleotydów do naprawy. W tym miejscu do gry wchodzą dwa enzymy, helikaza i topoizomeraza. Dlatego zarówno helikaza, jak i topoizomerazy są niezbędne w rozwijaniu DNA. Helikaza rozdziela dwuniciowy DNA na pojedyncze nici, rozbijając wiązania wodorowe między parami zasad nukleotydów w dwuniciowym DNA. W przeciwieństwie do tego, topoizomeraza rozplątuje skręt DNA i łagodzi naturę superskrętu DNA, przecinając szkielet fosforanowy DNA w jednej lub obu niciach.
