Kluczowa różnica - SYBR Green vs Taqman
SYBR Green i Taqman to dwie metody wykorzystywane do wykrywania lub obserwowania procesu amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym. SYBR Green to metoda oparta na interkalacyjnym barwieniu kwasu nukleinowego, natomiast Taqman jest metodą opartą na sondzie hydrolizującej. Obie technologie mają na celu generowanie fluorescencji podczas reakcji PCR, co umożliwia maszynie PCR w czasie rzeczywistym monitorowanie reakcji w „czasie rzeczywistym”. Metoda SYBR Green jest przeprowadzana przy użyciu barwnika fluorescencyjnego o nazwie SYBR green i wykrywa amplifikację poprzez wiązanie barwnika z wytworzonym dwuniciowym DNA. Taqman przeprowadza się przy użyciu podwójnie znakowanych sond i wykrywa amplifikację przez degradację sondy przez polimerazę Taq i uwalnianie fluoroforu. To jest kluczowa różnica między SYBR Green i Taqman.
SPIS TREŚCI
1. Przegląd i kluczowa różnica
2. Co to jest SYBR Green
3. Co to jest Taqman
4. Porównanie obok siebie - SYBR Green vs Taqman
5. Podsumowanie
Co to jest SYBR Green?
SYBR Green to barwnik fluorescencyjny stosowany do barwienia kwasów nukleinowych, zwłaszcza dwuniciowego DNA w biologii molekularnej. Metoda SYBR Green jest stosowana do ilościowego określania produktów PCR podczas PCR w czasie rzeczywistym. Po związaniu się z DNA powstały kompleks barwnika DNA pochłania światło niebieskie i emituje intensywne światło zielone. Dzieje się tak z powodu zmiany strukturalnej, która zachodzi w cząsteczce barwnika po związaniu z dwuniciowym DNA. Kiedy PCR tworzy coraz więcej DNA, więcej cząsteczek barwnika wiąże się z DNA, generując więcej fluorescencji. Dlatego fluorescencja wzrasta wraz z akumulacją produktu PCR. W związku z tym ilość produktu PCR można mierzyć ilościowo za pomocą detekcji fluorescencyjnej SYBR Green.
Zielony barwnik SYBR może być również stosowany do znakowania DNA w cytometrii i mikroskopii fluorescencyjnej. Bromek etydyny został z powodzeniem zastąpiony przez SYBR Green, ponieważ bromek etydyny jest barwnikiem rakotwórczym i ma problemy z utylizacją podczas wizualizacji DNA w elektroforezie żelowej.
Metoda SYBR green ma zalety i wady. Ta metoda jest bardzo czuła, niedroga i łatwa w użyciu. Jednak ze względu na jego zdolność do wiązania się z dowolnym dwuniciowym DNA, niespecyficzne wiązanie może prowadzić do nadmiernej ilościowej oceny produktu PCR.
Rysunek 01: SYBR Green Technique
Co to jest Taqman?
Taqman jest alternatywną dla SYBR Green metodą monitorowania procesu PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta zależy od aktywności egzonukleazy 5 '- 3' enzymu polimerazy Taq w celu degradacji sond podczas wydłużania nowej nici i uwalniania fluoroforu. W metodzie tej wykorzystuje się sondy podwójnie znakowane, a jej podstawą jest hydroliza sond. Sondy są znakowanymi fluorescencyjnie oligonukleotydami DNA zawierającymi fluorescencyjną cząsteczkę reporterową (fluorofor) na końcu 5 'i cząsteczkę wygaszacza na końcu 3'. Są zaprojektowane tak, aby wiązały się z jednoniciowym szablonem po przeciwnej stronie wyżarzania podkładu. Polimeraza Taq dodaje nukleotydy do startera i wydłuża nową nić w kierunku podwójnie znakowanych sond. Gdy polimeraza Taq dotknie sondy, działanie egzonukleazy polimerazy Taq aktywuje i degraduje sondę. Po zakończeniu syntezy nowej nici sonda jest poddawana całkowitej degradacji i uwalnianiu fluoroforu. Uwalnianie fluoroforu generuje fluorescencję. Fluorescencyjna cząsteczka wygaszacza skutecznie tłumi emitowane światło i tworzy dane wyjściowe do ilościowego określenia produktu PCR. Uwalnianie fluoroforów i ilość produktów PCR są proporcjonalne. Dlatego kwantyfikację można łatwo przeprowadzić metodą Taqmana.kwantyfikację można łatwo przeprowadzić metodą Taqmana.kwantyfikację można łatwo przeprowadzić metodą Taqmana.
Rysunek 02: Metoda Taqmana
Metoda Taqman jest stosowana w czasie rzeczywistym PCR, kwantyfikacji ekspresji genów, wykrywaniu polimorfizmów genetycznych, kwantyfikacji delecji chromosomalnego DNA, identyfikacji bakterii, weryfikacji analizy mikromacierzy, genotypowaniu SNP itp.
Jaka jest różnica między SYBR green i Taqman?
Porównaj środek artykułu przed tabelą
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green jest oparty na barwniku wiążącym DNA. | Taqman zależy od sond hybrydyzacyjnych i aktywności egzonukleazy 5 'do 3' polimerazy Taq. |
| Sondy znakowane fluorescencyjnie | |
| Nie są wymagane żadne sondy znakowane fluorescencyjnie. | Wymagane są sondy znakowane podwójnie. |
| Analiza genów multipleksowych | |
| Nie można go stosować do multipleksowych celów genowych. | Może być stosowany do celów multipleksowych genów. |
| Koszt | |
| To jest tańsze. | To jest droższe. |
| Specyficzność | |
| Jest to mniej specyficzne i wiąże się z dowolnym dwuniciowym DNA | Są one wysoce specyficzne, ponieważ sondy wykrywają określone produkty amplifikacji. |
| Skuteczność | |
| To jest mniej skuteczne. | Jest to bardzo skuteczne. |
| Podanie | |
| Jest to używane w PCR w czasie rzeczywistym, wizualizacji żelu agarozowego, znakowaniu DNA itp. | Jest to wykorzystywane w PCR w czasie rzeczywistym, kwantyfikacji ekspresji genów, wykrywaniu polimorfizmów genetycznych itp. |
Podsumowanie - SYBR Green i Taqman
Taqman i SYBR green to dwie metody stosowane w real-time PCR (ilościowa PCR). Obie metody umożliwiają wydajne ilościowe oznaczenie produktu PCR i polegają na emisji fluorescencji. Metoda Taqman wykorzystuje sondy znakowane podwójnie do wykrywania nagromadzonego DNA, podczas gdy metoda SYBR Green wykorzystuje barwnik fluorescencyjny. Obie te metody mają również różne zastosowania w biologii molekularnej.
